外星异族降临地球后，人类成了“二等公民”。三个曾反抗外星人失败的伙伴，如今时过境迁境遇各不相同：坂田银时（小栗旬 饰）整日晃晃悠悠没正经、成立了什么业务都接的“万事屋”；桂小太郎（冈田将生 饰）继续组织着反抗异族的力量、延续对抗；高杉晋助（堂本刚 饰）则变成了憎恨世界的人，为毁灭一切不择手段；一把意外出现的妖刀“红樱”杀人事件，把曾经一起战斗的三个伙伴重新串联在一起……

由原作动画“真选组暗杀篇”为主线剧情，并另外搭配短篇搞笑日常组成。 真选组副长土方十四郎在护卫将军的过程中，遭遇浪士偷袭，脖子被植入芯片，以至于行为御宅化，对于二次元事物无法抗拒，洽逢真选组参谋—伊东鸭太郎归队，野心勃勃的伊东策划排挤土方，并与鬼兵队联手，企图在列车上暗杀组长近藤勋。 土方在意识清醒时委托万事屋保护真选组，阿银一行人也因此意外卷入事件，并在过程中意外发现鬼兵队河上万斋等人的真正阴谋…