渐渐习惯了现代生活的美国队长史蒂夫·罗杰斯（克里斯·埃文斯 饰），在一次行动后隐隐嗅到神盾局内部所弥漫出来的凶险气味。而当得知神盾局正秘密进行的“洞察计划”后，他更为此感到愤怒。某天，神盾局指挥官尼克-法瑞（塞缪尔·杰克逊 饰）遭到一群武装分子袭击，他拼尽全力将一支U盘交到美国队长手中，这里面藏着该局二战以来最重要且最可怕的秘密。在此之后，美国队长因涉嫌杀害尼克而遭到前局长亚历山大·皮尔斯（罗伯特·雷德福 饰）的通缉和追杀，逃亡中他得到黑寡妇（斯嘉丽·约翰逊 饰）和退伍老兵“猎鹰”（安东尼·麦凯 饰）的帮助。他们必须争分夺秒解开神盾局的秘密，阻止“洞察计划”的施行……

故事发生在遥远的26世纪，外科医生依德（克里斯托弗·瓦尔兹 Christoph Waltz 饰）在垃圾场里捡到了只剩下头部的机械少女将她带回家中，给她装上了本来为自己已故的女儿所准备的义体，并取名阿丽塔（罗莎·萨拉扎尔 Rosa Salazar 饰）。苏醒后的阿丽塔对这个五彩斑斓但却暴力而又残酷的世界产生了浓厚的兴趣，在结识了青年雨果（基恩·约翰逊 Keean Johnson 饰）后，阿丽塔开始接触名为机动球的运动，并在比赛中展现出了惊人的格斗天赋。
在废铁城居民们的头顶，漂浮着巨大的浮空城市撒冷，废铁城居民们的一切劳作和付出，都是为了给撒冷提供继续运作的燃料。在大财阀维克特（马赫沙拉·阿里 Mahershala Ali 饰）所设立的机动球比赛中，最终获得冠军的人能够获得前往撒冷生活的资格，阿丽塔决定利用自己的格斗天赋参加比赛，却被卷入了一个巨大的阴谋之中。

正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。
他们合力与恶势力展开斗争……