大战绿魔之后，蜘蛛侠彼得·帕克忍痛拒绝了他唯一的挚爱玛丽，因为蜘蛛侠的身份会为自己和亲人带来巨大危险，帕克决定独立承担起蜘蛛侠的责任。帕克一直在忙于应付各种挑战：学习超能力的灵活运用；在超级英雄与平凡大学生的双重身份下隐藏自我、小心翼翼地生活等等。帕克对玛丽越来越难以自拔，但是作为蜘蛛侠又不能对玛丽展开心扉。好友哈利因为误会蜘蛛侠而一直处处与其为作对；唯一的亲人梅婶婶也对蜘蛛侠的真实身份产生了怀疑。同时，新的挑战又出现了：邪恶而强大的章鱼博士。帕克在种种压力下肩负起蜘蛛侠的使命。

彼得帕克（托比•马奎尔 Tobey Maguire 饰）是美国一个平凡的高中生，当他被哥伦比亚大学科学展会偷跑出来的变种蜘蛛咬了一口之后，生活彻底改变了。他变得和蜘蛛一样，拥有各种蜘蛛特有的超能力：从手腕喷出粘力极强的蜘蛛丝、飞檐走壁等等。
彼得兴奋异常，为引起玛丽简的注意，开始利用自己的超能力去赚钱。但当他最爱的叔叔被自己放走的罪犯杀死后，彼得发誓要用自己的超能力去打击犯罪。
彼得视其为兄弟的朋友哈利奥斯本的父亲诺曼奥斯本（威廉•达福 Willem Dafoe 饰）因彼得的科学天赋而非常喜爱他，视其为家人，以至于引起哈利的嫉妒。同时，哈利和玛丽简恋爱，令彼得心中很不痛快。
诺曼是美国最大军事承包商之一的CEO，因公司的超级士兵计划进度达不到军方要求，被以撤走投资作为威胁而苦恼不堪，决定以自己作为实验对象，他吸入血清后具有了超能力，却不幸出现意外，出现十分邪恶的第二人格绿哥布林，哥布林驾驶着滑翔机在纽约城内杀人搞破坏，试图招募蜘蛛侠。
面对身边的误解、威胁和诱惑，彼得会怎么样行事呢？

正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。
他们合力与恶势力展开斗争……

在与灭霸史诗般的战争结束后，地球似乎暂时回归和平。皮特（汤姆·赫兰德 饰）回到了校园生活之中，他和好友相谈甚欢，并且有了心仪的女孩，然而内心最深处依然放不下对钢铁侠的追悼缅怀。去往欧洲游学的路上，皮特试图找机会和个性女孩米歇尔（赞达亚 饰）表白，谁知接连出现的元素怪兽打乱了他的表白计划。在这一过程中，与神盾局合作的神秘客（杰克·吉伦哈尔 饰）挺身而出，击退怪兽。自感不堪大任的皮特谢绝了尼克·弗瑞（塞缪尔·杰克逊 饰），情愿将钢铁侠继承者的重任交到神秘客手中。
令他意想不到的是，更可怕的危机接二连三袭来……

跟父亲关系破裂的格温·史黛西，在对付来自异时空的反派秃鹫时，遇到“蜘蛛女侠”杰西卡·德鲁以及堪称团队领袖的“蜘蛛侠2099”米格尔·欧哈拉，得以前往所有蜘蛛侠的大本营。另一边，成了他所在的宇宙唯一蜘蛛侠的迈尔斯·莫拉莱斯，虽然本领越来越娴熟，但不时对自己的身份、跟父母的关系感到十分迷惘，更因为无法见到同伴而倍感孤独。而格温的意外到来，令迈尔斯欣喜不已，两人却没能阻止反派斑点的逃脱。被带到大本营的迈尔斯，遭到米格尔的敌视，并知道了关于自己身世的大秘密。为了返回所在的宇宙，他不得不跟所有蜘蛛侠大打出手，但事情却朝着意想不到的方向发展。