童年的一起突发事件，令彼得·帕克和父母生离死别。转眼彼得成为一名高中生，他偶然发现父亲的公文包，并从叔父本处得到线索，于是启程前往奥斯库公司拜访父亲当年的合作伙伴——科特·康纳斯博士。在公司内四处寻找线索的彼得意外被蜘蛛咬了一口，回程途中他的身体发生奇异的变化。在康纳斯博士德引导下，彼得不断了解并发掘体内着超乎寻常的能力，喜怒哀乐，各种意想不到的事情迅速向他袭来。直到某日，他便成了影响深远的超级战士蜘蛛侠。而城市内也出现了凶恶的蜥蜴人，彼得不平凡的人生就此展开。

阴云密布的高谭市，自蝙蝠侠消失的十年里，变种人团伙为非作歹，变本加厉，将这座繁华城市变成充满恐怖和凶杀的罪恶王国。嫉恶如仇的吉姆·戈登探长（大卫·塞尔比 David Selby 配音）行将退休，却不免成为变种人下一个袭击的目标。随着双面人哈维·登特（韦德·威廉姆斯 Wade Williams 配音）走出精神病院，高谭市被带入更加阴冷的黑暗之中。与此同时，富翁布鲁斯·韦恩（彼得·威勒 Peter Weller 配音）置身事外，享受着养尊处优的上流生活。而旧日记忆的复苏，一步步引导着他再次拿起搁置已久的战斗服。夜幕降临，老态龙钟的蝙蝠侠穿梭城市的阴暗角落，以无情的手段惩治恶徒。
正义战士归来，正邪之争日趋白热化……