年轻指挥家亚德里安（奎姆·古铁雷兹 Quim Gutiérrez 饰）的女友贝伦（克拉拉·拉戈 Clara Lago饰）失踪了，活不见人死不见尸，只留下一段视频讯息。郁闷的亚德里安不断被警察怀疑和调查，烦不胜烦之下到小酒馆浇愁，一不小心喝的大醉，受到女招待法比安娜（玛蒂娜·加西亚 Martina García）照顾，两人迅速陷入新的恋情。很快，法比安娜住进亚德里安的大宅，敏感的她时时感到房子里面不对劲，浴室里面好像总有奇怪的声音，亚德里安对此不以为意，但法比安娜开始时时留心，还一度怀疑是他前女友的鬼魂作祟。一天，在卧室更衣的法比安娜拾到一把古怪的钥匙，似乎接近了一个天大的秘密……

正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。
他们合力与恶势力展开斗争……