距今50多年前，一艘来自赛博坦的飞船坠落月球，由此引发了美苏两国的太空竞赛。人类争相登上月球，只为一探飞船残骸中的秘密。时间回到21世纪初，经过几番征战，汽车人终于挫败霸天虎的入侵，继而与人类合作，共同保卫美丽的地球。然而发生在切尔诺贝利的事件却将尘封已久的月球计划重新摆到桌面。为了防止霸天虎找到能量柱为非作歹，擎天柱与战友飞赴月球，更从当年的飞船中救出了汽车人的先代领导者——御天敌。御天敌是能量柱的发明者，将上百根能量柱集合在一起便可制造太空桥，实现物质的瞬间传送。
忙着找工作以及和女友卡莉（罗茜·汉丁顿-惠特莉 饰）经营爱情的山姆（希亚·拉博夫 饰）无可避免地卷入其中，他渐渐发现霸天虎的操纵一切的阴谋，却不知更大的阴谋和危机隐藏在那月影背后……

大战绿魔之后，蜘蛛侠彼得·帕克忍痛拒绝了他唯一的挚爱玛丽，因为蜘蛛侠的身份会为自己和亲人带来巨大危险，帕克决定独立承担起蜘蛛侠的责任。帕克一直在忙于应付各种挑战：学习超能力的灵活运用；在超级英雄与平凡大学生的双重身份下隐藏自我、小心翼翼地生活等等。帕克对玛丽越来越难以自拔，但是作为蜘蛛侠又不能对玛丽展开心扉。好友哈利因为误会蜘蛛侠而一直处处与其为作对；唯一的亲人梅婶婶也对蜘蛛侠的真实身份产生了怀疑。同时，新的挑战又出现了：邪恶而强大的章鱼博士。帕克在种种压力下肩负起蜘蛛侠的使命。

蜘蛛侠（托比•马奎尔 Tobey Maguire 饰）在经历了重重考验之后，成为了人人敬仰的正义英雄，抱得美人归。但是，光环下蜘蛛侠，也有自己的心病：他在第一集时放走了小偷导致最亲爱的叔叔被小偷杀死，帕克一直耿耿于怀。
生活顺意的帕克开始变得目中无人，当他再次抓到那个小偷时，残忍地看着他从楼上摔下致死，过后才发现自己惩罚错了人，真凶是“沙人”。当帕克将“沙人”残忍杀死后，帕克心内的阴暗面渐渐在帕克的身体内占据了上风，蜘蛛侠最终演变成邪恶的“毒蜘蛛”！糟糕的是，帕克没有察觉到自身的变化，帕克最终如何摆脱自身的邪恶？

彼得帕克（托比•马奎尔 Tobey Maguire 饰）是美国一个平凡的高中生，当他被哥伦比亚大学科学展会偷跑出来的变种蜘蛛咬了一口之后，生活彻底改变了。他变得和蜘蛛一样，拥有各种蜘蛛特有的超能力：从手腕喷出粘力极强的蜘蛛丝、飞檐走壁等等。
彼得兴奋异常，为引起玛丽简的注意，开始利用自己的超能力去赚钱。但当他最爱的叔叔被自己放走的罪犯杀死后，彼得发誓要用自己的超能力去打击犯罪。
彼得视其为兄弟的朋友哈利奥斯本的父亲诺曼奥斯本（威廉•达福 Willem Dafoe 饰）因彼得的科学天赋而非常喜爱他，视其为家人，以至于引起哈利的嫉妒。同时，哈利和玛丽简恋爱，令彼得心中很不痛快。
诺曼是美国最大军事承包商之一的CEO，因公司的超级士兵计划进度达不到军方要求，被以撤走投资作为威胁而苦恼不堪，决定以自己作为实验对象，他吸入血清后具有了超能力，却不幸出现意外，出现十分邪恶的第二人格绿哥布林，哥布林驾驶着滑翔机在纽约城内杀人搞破坏，试图招募蜘蛛侠。
面对身边的误解、威胁和诱惑，彼得会怎么样行事呢？