突袭世界的大灾难“第二次冲击”后，世界在废墟之上重建。14岁的少年碇真嗣被父亲碇元渡叫到第3新东京市。本以为能见到父亲迎接的他，却见到名为“使徒”的巨大生物与军队交火。危急之下，特务机关NERV的葛成美里将真嗣救下，并将其带往碇元渡所统领的NERV总部。但迎接真嗣的，却是是父亲冷酷地命令：驾驶称为“EVA”的巨大人型机器人与使徒战斗。
本已表示拒绝的真嗣，看到重伤的替补驾驶员绫波丽后，决定遵从父亲的命令。就这样，从未受过作战训练的真嗣，准备驾驶EVA初号机迎战使徒。
世界的命运托付在了一位年仅14岁的少年身上，而“第二次冲击”所隐藏的“人类补完计划”似乎也开始了行动。掌握一切答案的碇元渡，却只是不动生色地观察，仿佛一切早已写入剧本。

在参拜母亲坟墓的回程途中，真嗣（绪方惠美 配音）和葛城美里（三石琴乃 配音）遭遇了第七使徒的攻击，关键时刻2号机势如破竹挫败对手，真嗣也由此结识了2号机的操纵者式波·明日香·兰格蕾（宫村优子 配音）。与沉默寡言的绫波丽（林原惠美 配音）不同，明日香自信张扬，甚至有些自大，在和真嗣相处的日子里，彼此闹出不少的笑话。他们三人分别驾驶着零号机、初号机和2号机，抵抗了第八使徒猛烈的攻击，在这一过程中，淡淡的情愫悄然在这三个青年男女的心中萌生。不久后，第九、十使徒相继降临，真嗣他们面临着生与死的残酷考验……
本片为福音战士新剧场版四部曲第二部。

成为“第三次冲击”元凶的碇真嗣，变得像废人一样……真嗣还能振作起来吗？2012年《福音战士新剧场版：Q》之后，这部动画讲述了被封印的故事的后续。