繁华大都会纽约，光影交错的人间乐土，相应有层出不穷的罪恶侵蚀着这片土地。小青年彼得·帕克（Christopher Daniel Barnes 配音）和唯一的亲人梅婶（Linda Gary 饰）相依为命，如许许多多美国青年一样穿行在繁忙的闹市街头。可就是这个平凡无奇的大男孩，却被一只受过辐射的蜘蛛咬中，继而改变了命运。在此之后，彼得发现他具有种种神奇的能力，而能力的增长又促使他成为独立于司法之外的正义战士，以蜘蛛侠的名头和各种各样的恶势力展开斗争。在此之后，毒蝎、章鱼博士、毒液、绿魔等可怕的对手交替登场，正邪双方在纽约各个角落展开接二连三的较量。在此期间，彼得还必须兼顾他英雄的另一面，小心平衡着和女友玛丽以及工作之间的关系。
蜘蛛侠的故事就在一片朝气蓬勃中渐次上演……

只因不小心被一只受过放射性感染的蜘蛛咬伤，平凡瘦弱的高中生彼得·本杰明·帕克（尼尔·帕特里克·哈里斯 Neil Patrick Harris 饰）的人生便发生了翻天覆地的变化。从此以后，他穿上红蓝相间的紧身服，戴上面具，凭借发射出的蜘蛛丝穿梭在喧哗闹市的每一个角落。“能力越大，责任越大”，彼得以蜘蛛侠的身份，和破坏城市及世界和平的恶势力作斗争。全新的征程，更强大的敌人，女武士鹿田、The Talon、电王（Ethan Embry 配音）、蜥蜴人（罗布·赞比 Rob Zombie 配音）、银貂（Virginia Madsen 配音）等可怕对手相继登场。蜘蛛侠从不退却，勇敢地迎上前去……
本片为采用3D技术制作的新版动画。