正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。
他们合力与恶势力展开斗争……

跟父亲关系破裂的格温·史黛西，在对付来自异时空的反派秃鹫时，遇到“蜘蛛女侠”杰西卡·德鲁以及堪称团队领袖的“蜘蛛侠2099”米格尔·欧哈拉，得以前往所有蜘蛛侠的大本营。另一边，成了他所在的宇宙唯一蜘蛛侠的迈尔斯·莫拉莱斯，虽然本领越来越娴熟，但不时对自己的身份、跟父母的关系感到十分迷惘，更因为无法见到同伴而倍感孤独。而格温的意外到来，令迈尔斯欣喜不已，两人却没能阻止反派斑点的逃脱。被带到大本营的迈尔斯，遭到米格尔的敌视，并知道了关于自己身世的大秘密。为了返回所在的宇宙，他不得不跟所有蜘蛛侠大打出手，但事情却朝着意想不到的方向发展。